Микробы

Впервые аминокислотные последовательности ядерной локализации были обнаружены на С-конце субъединиц молекулы нуклеоплазмина (ядерный белок, принимающий участие в структуризации хроматина). Эти эксперименты были проведены на бесклеточной системе, когда выделенные ядра помещались в цитоплазматический экстракт ооцитов ксенопуса, куда добавляли нативные или измененные молекулы нуклеоплазмина. Это крупный белок (125 кД), состоящий из пяти субъединиц, каждая из которых обладает глобулярной и фибриллярной, С-концевой, частями. Если удалит путем протеолиза примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни пентамер, ни мономеры в ядро не попадают, в то время как отщепленные фибриллярные участки через поры проходят свободно, так как содержат NLS-участок.

Более того, при смешивании неядерных белков с этими NLS-фрагментами, такие комплексы способны транспортироваться в ядро. Даже крупные частицы декстрана (20 нм), неспособные проникать в ядро, при связывании с ними NLS-последовательностей нуклеоплазмина транспортировались из цитоплазматического экстракта в ядро.

Подробно строение NLS изучено у белка Т антигена вируса SV40. Кариофильный сигнал состоял из последовательности: Pro-Lys-128Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Одна лишь аминокислотная замена (128Lys на Thr или Asp) полностью лишают этого фрагмента кариофильных свойств. Оказалось. что можно создавать химерные белки с этим аминокислотным доменом, что позволяет необычные для ядер белки (альбумин плазмы, иммуноглобулин G, и даже ферритин с мол. массой 465 кД) транспортировать через ядерные поры.

Было показано, что белок с NLS проходит в ядро через несколько этапов (рис. 111). Импорт начинается с того, что NLS-белок связывается с гетеродимером рецептора NLS, с белками импортинами a и b, локализованными в цитоплазме. Возникший белковый комплекс (импортируемый белок с NLS, связанный с импортинами a и b) подходит к внешней ядерной мембране и закрепляется на цитоплазматических филаментах порового комплекса. Затем этот комплекс входит в ядерную пору и проходит через “транспортер”. Считается, что транспортер состоит из множества извитых белковых филаментов, обогащенных аланином и глицином (FG-филаменты), представляющих собой барьер для транспорта некариофильных белков. Комплекс же, имеющий NLS как бы разрыхляет эту сеть и проходит через канал транспортера. После перехода комплекса в нуклеоплазму импортин b связывается с белком RAN, представляющего собой малую GTP-азу, что приводит к распаду комплекса. Импортируемый белок освобождается и остается в ядре, импортин a возвращается в цитоплазму, так же как и импортин b, но в связи с RAN-GDP, где последние также диссоциируют. Тем самым только белок с NLS остается в составе ядра (рис. 111).